분자 신경변성 18권, 기사 번호: 8(2023) 이 기사 인용
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이 기사의 수정본은 2023년 4월 28일에 게시되었습니다.
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TREM2(골수 세포에서 발현되는 유발 수용체 2)의 희귀한 p.H157Y 변종은 알츠하이머병(AD) 위험을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다. 이 돌연변이는 TREM2 세포외 도메인의 절단 부위에 위치합니다. HEK293 세포에서 TREM2-H157Y의 이소성 발현은 TREM2 발산을 증가시켰습니다. 그러나 TREM2 H157Y 돌연변이의 생리학적 결과는 AD 관련 병리의 유무에 관계없이 알려지지 않은 채로 남아 있습니다.
우리는 CRISPR/Cas9 기술을 통해 새로운 Trem2 H157Y 녹인 마우스 모델을 생성하고 생화학적 분석, TREM2, 해마의 표적 질량 분석 분석을 수행하여 TREM2 단백질 분해 처리, 시냅스 기능 및 AD 관련 아밀로이드 병리에 대한 Trem2 H157Y의 효과를 조사했습니다. 전기 생리학, 면역 형광 염색, 생체 내 미세 투석 및 대뇌 피질의 대량 RNA 시퀀싱.
이전의 시험관 내 연구 결과와 일치하여 Trem2 H157Y는 뇌와 혈청에서 가용성 TREM2 수준이 높아져 TREM2 배출을 증가시킵니다. 또한 Trem2 H157Y는 소교세포 밀도 및 형태 또는 TREM2 신호에 영향을 주지 않고 시냅스 가소성을 향상시킵니다. 아밀로이드 병리가 있는 경우 Trem2 H157Y는 아밀로이드-β(Aβ) 제거를 가속화하고 두 개의 독립적인 창립 계통에서 아밀로이드 부담, 영양 장애 신경돌기 및 신경교증을 감소시킵니다. TREM2의 표적 질량 분석법 분석은 야생형 TREM2에 비해 가용성 대 전장 TREM2-H157Y의 비율이 더 높은 것으로 나타났으며, 이는 H157Y 돌연변이가 Aβ 존재 하에서 TREM2 발산을 촉진한다는 것을 나타냅니다. TREM2 신호전달은 Trem2 H157Y 동형접합성 마우스에서 감소된 것으로 추가로 발견되었습니다. 전사체 프로파일링에 따르면 Trem2 H157Y는 신경염증 관련 유전자와 아밀로이드 병리와 상관관계가 있는 면역 모듈을 하향 조절하는 것으로 나타났습니다.
종합하면, 우리의 연구 결과는 시냅스 기능과 아밀로이드 병리 완화에 있어서 Trem2 H157Y 돌연변이의 유익한 효과를 시사합니다. TREM2 p.H157Y와 AD 위험의 유전적 연관성을 고려할 때, 우리는 인간의 TREM2 H157Y가 추가 조사가 필요한 타우병증 및 신경변성에 미치는 영향과 같은 아밀로이드 독립적 경로를 통해 AD 위험을 증가시킬 수 있다고 추측합니다.
알츠하이머병(AD)은 세포외 아밀로이드 플라크 및 신경내 과인산화 타우 엉킴의 병리학적 침착뿐만 아니라 신경병리 및 신경변성에 반응하는 두드러진 소교세포 활성화를 특징으로 하는 만성 신경퇴행성 질환입니다[1,2,3]. 다수의 소교세포 유전자 변이가 AD 위험과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌습니다[4]. 그중 TREM2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2)의 p.H157Y 변이체는 상대적으로 적은 수의 운반체에서 확인되었으며 교차비(OR)가 11.01(MAF)로 증가된 AD 위험을 부여했습니다. 한족 코호트에서는[5], 알츠하이머병 염기서열 분석 프로젝트에 사용된 백인 코호트에서는 OR이 4.7(MAF, 0.06%)[6]이었습니다. 그러나 이 희귀한 TREM2 변종이 어떻게 AD 위험에 기여하는지는 명확하지 않습니다.
TREM2는 중추신경계의 소교세포와 말초의 골수 세포(예: 대식세포)에서만 발현되는 면역수용체입니다[7]. 이는 Ig 유사 V 유형 도메인, 줄기 영역, 막횡단 도메인 및 짧은 세포질 꼬리로 구성됩니다[8]. TREM2의 대부분의 AD 위험 변종(예: p.R47H, p.R62H)은 Ig 유사 도메인을 인코딩하는 exon2에 위치합니다[9,10,11]. 이러한 병원성 돌연변이는 주로 아밀로이드-β(Aβ) 올리고머[12,13,14], 원섬유형 Aβ 관련 음이온 지질[15], LDL[6, 16], HDL[6]과 같은 리간드의 비효율적인 결합을 초래합니다. 아포지단백질 [16, 17]. 이러한 손상은 시험관 내 식균작용[16, 18, 19] 및 생체 내 아밀로이드 플라크 삼킴의 소교세포 기능 장애와 관련이 있습니다[20, 21]. 대조적으로, p.H157Y 변종은 줄기 영역을 인코딩하는 엑손3에 위치합니다. 흥미롭게도 H157-S158 부위는 가용성 TREM2(sTREM2)가 생성되는 ADAM10/17 절단 부위로 확인되었습니다[22,23,24]. HEK293 세포에서 TREM2-H157Y의 이소성 발현은 조건화된 배지에서 sTREM2를 증가시키고 막 관련 성숙한 전장 TREM2를 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다[23, 24]. 증가된 TREM2 발산은 HEK293 세포에서 pHrodo-E.Coli의 식균 작용 장애와 관련이 있을 수 있으며[23] 2B4 T 세포에서 포스파티딜세린에 반응하여 TREM2 신호 전달 활성화가 감소했습니다[6]. 이러한 시험관 내 관찰에도 불구하고 TREM2 H157Y 돌연변이의 생체 내 결과는 아직 알려지지 않았습니다.
8 µm [32, 33]) numbers divided by the ROI areas. For IBA1 staining in the non-amyloid mice, a unified intensity threshold was applied to recognize the microglial cell body followed by particle analysis to examine the microglial density and cell body size. To further assess microglial morphology, 4–5 fields were taken per sample under confocal (Zeiss) at 20 × with a zoom factor 0.6. Images were processed to remove background and skeletonized followed by analysis of branch number, junction number and total branch length per microglia [34]./p> 0.25. Hierarchical clustering was performed in MATLAB using the Clustergram function based on standardized Euclidean distance metric. Volcano plots were generated in MATLAB using –log10 (FDR) as y axis and ± log2 (|FC|) as x axis. Pathway analyses of differentially expressed genes were performed through Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/products/ingenuity-pathwayanalysis) [48]./p> 2 suggests moderate preservation and Z summary score > 10 suggests strong preservation./p> T substitution in exon3 through CRISPR/Cas9 technology to create the missense H157Y mutation (Fig. 1A). Two founders (1 and 2) were obtained with no off-target mutation observed in the offspring from either founder (Fig. S1A-B). Results reported below were generated using the offspring of founder 1 unless otherwise stated. By crossing the Trem2 H157Y heterozygous mice, we obtained three genotypes: wild type (Trem2+/+, referred to as WT), heterozygous (Trem2+/H157Y, referred to as Het), and homozygous (Trem2H157Y/H157Y, referred to as Hom). Littermates of these three genotypes were used to investigate the impacts of the Trem2 H157Y mutation on TREM2 proteolytic processing, microglial density and morphology, synaptic plasticity, and cognitive function./p> T mutation (bold orange) via CRIPR/Cas9. Protospacer region recognized by guide RNA (gRNA) is shown in orange. Protospacer adjacent region (PAM) is indicated in green. B-C. Cortical Trem2 mRNA levels were examined using primers targeting exon 2 (N-terminal, B) or exon 4–5 (C-terminal, C), and normalized to WT mice for each genotype. D. Cycle threshold ratios of C-terminal Trem2 to N-terminal Trem2 (C/N Trem2) were calculated and normalized to WT mice for each genotype. E–F. TREM2 levels were examined by ELISA and normalized to WT mice in cortical TBS (E) and TBSX (F) lysates for each genotype. G-H. TREM2 levels were examined by ELISA in conditioned medium (CM) (G) and RIPA lysates (H) of primary microglia (MG). TREM2 amount was normalized to the total protein level of cell lysates followed by another normalization to WT littermates. N = 8–11 pups per genotype. Unknown sex of each pup. I. Serum TREM2 were examined by ELISA in mice from each genotype. J. SYK, phosphorylated SYK (pSYK) and actin were detected in the RIPA lysates of isolated microglia from WT and Hom mice. K-L. pSYK (K) and SYK (L) were quantified and normalized to WT. M. Ratios of pSYK/SYK were calculated and normalized to the WT mice. B-F, I. N = 11–14 mice per genotype at 6 months of age, mixed sex. Kruskal–Wallis tests with uncorrected Dun’s multiple comparisons were used in B-I. J-M. N = 6 mice/genotype at 6 months of age, mixed sex. Unpaired t-tests were used. Data are presented as Mean ± SEM. N.S., not significant. * p < 0.05. **p < 0.01/p> 1.2; FDR< 0.05) were identified and indicated in red or blue in the volcano plot. B. Hierarchical clustering for DEG expression (Hom vs WT) is shown across each sample. DEGs involved in the top 10 pathways (C) are shown in blue. C. Top 10 DEG related pathways were identified through Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Red dashed line indicates the FDR threshold, 0.05. D. Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) identified a unique magenta module which is downregulated in Hom and correlated with amyloid pathological readouts. E. Magenta module eigengenes (ME) were compared between WT and Hom mice. Data are presented as Mean ± SEM. Wilcoxon rank sum test was used. F. Top 10 gene ontology (GO) terms (FDR < 0.05) are shown for the magenta module. G. Network plot of genes involved in the top 10 GO terms was generated through Cytoscape. H. TNF-α in the TBS lysate was quantified and normalized to WT mice for each genotype. N = 19–24 mice per genotype at 8.5 months of age, mixed sex. Data are presented as Mean ± SEM. Kruskal–Wallis tests with uncorrected Dun’s multiple comparisons were used. * p < 0.05. **p < 0.01/p>
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